人脑胶质瘤中BMI1 的表达及其意义

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  • 时间:02/27/2016
  • 来源:万方数据库

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  人脑胶质瘤中BMI1 的表达及其意义

  作者:朱爱华 陆华 肖新如 赵理 陈涛 刘伟 彭小忠 袁建刚 赵继宗

  摘要目的:研究基因BMI1在中枢神经系统最常见的肿瘤-胶质瘤组织中的表达情况,并探讨其表达水平与胶质瘤的恶性程度及发生、发展的关系。方法:使用荧光定量实时PCR技术检测基因BMI1在34例各级别胶质瘤手术切除组织及10例正常对照组织中的表达。同时对34例各级别胶质瘤组织及10例正常对照脑组织使用免疫组化的方法检测BMI1蛋白的表达。结果:实时PCR的结果显示,基因BMI1在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤及 Ⅳ级胶质瘤组织中的表达相对值分别为0.655、2.65、5.62及5.43。胶质瘤组中BMI1的表达水平显著高于对照组(P=0.001),恶性胶质瘤组(Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤)中BMI1的表达水平显著高于良性胶质瘤(Ⅱ级胶质瘤),P=0.015,Ⅲ 级胶质瘤组与Ⅳ级胶质瘤组之间未发现存在差异(P=0.902);免疫组化结果显示,BMI1蛋白在对照脑组织、Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤和Ⅳ级胶质瘤组织中的表达阳性率分别为10%、25%、100%和100%。各级别胶质瘤组织中BMI1 蛋白的阳性表达率显著高于正常脑组织对照组(P=0.001),而且在恶性胶质瘤组织中BMI1蛋白的阳性表达率显著高于良性胶质瘤(P=0.000)。结论:无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上,BMI1在各级别脑胶质瘤标本中的表达水平均明显高于正常脑组织对照,且恶性胶质瘤中BMI1的表达要明显高于良性胶质瘤。BMI1在胶质瘤的发生、发展过程中有重要作用。

  关键词:胶质瘤 BMI1 实时PCR 免疫组化 多梳家族

  BMI1 是目前研究中最深入的哺乳动物PcG 家族成员。PcG 蛋白―多梳家族蛋白(Polycomb group protein)是一类在染色质水平抑制靶基因转录的蛋白,在胚胎发育、细胞记忆、细胞周期、细胞增殖和肿瘤形成等过程中起到非常重要的作用。胶质瘤是神经系统最常见的肿瘤。BMI1在很多肿瘤中处于高表达的状态,如髓母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等。本研究主要采用实时PCR和免疫组化的方法对胶质瘤中BMI1 的表达情况进行检测。

  1 材料与方法

  1.1 病例资料收集

  2005 年5 月~2005 年10 月北京天坛医院神经外科34 例胶质瘤手术标本,其中男18 例,女16 例;年龄17~62 岁,平均年龄42.3 岁。其中WHO 分级Ⅱ级星形细胞瘤12 例,Ⅲ级间变星形细胞瘤12 例,Ⅳ级胶质瘤母细胞瘤10 例。同时收集对照脑组织标本共10 例,包括脑外伤组织、瘤旁组织、内减压脑组织、癫痫切除颞角组织等。

  1.2 实时PCR

  采用提取总RNA 试剂盒(美国Invitrogen 公司)从所有组织中提取全部RNA,然后使用MMLV(反转录酶)试剂盒(美国Biolabs 公司)将所有的RNA 转化为cDNA。实时PCR 仪为Applied Biosystems,ABI 7500 型,PCR 反应混合溶液为10μl SYBR Green PCR 预混试剂(ABI 公司),1μl 稀释的模板,2μl 引物对(5μM),7μl 无菌去离子水,每种引物,每种模板,各3 个平行管反应。BMI1 引物对为5'-ATTCTA CCAGTCCCGAGGTTTG-3',5'-GGTTCAACTGCTCA TCATAGCG-3';内参基因GAPDH 引物对为,5'-CA TCCATGACAACTTTGGTATC-3',5'-CCATCACGCC ACAGTTTC-3'。Real-time PCR 反应程序:95℃ 10min,95℃ 15s,60℃ 1min。循环重复第2、3 步40 次。计算同一个样品BMI1 的Ct 值与GAPDH 的Ct 值的比值,取3 个平行孔Ct 比值的平均数。做图时将正常组织的Ct 比值的平均数设为1.0,计算出所有样品的相对值后制图。

  1.3 免疫组化

  BMI1 免疫组化检测采用SP 法:石蜡切片脱蜡至水,抗原修复后,分别加入3%过氧化氢和5%~ 10%正常山羊血清,孵育后加入鼠抗人单克隆抗体(中杉生物技术有限公司),最后再分别加入二抗和辣根酶标记链霉卵白素,用DAB 染色,苏木精复染,常规脱水封片。即用型SP 试剂盒和液体DAB 酶底物显色试剂盒购自中杉生物技术有限公司。阳性判断:以瘤细胞内出现棕褐色颗粒为阳性,瘤细胞无棕褐色颗粒为阴性(-),阳性细胞数<25%为弱阳性(±),阳性细胞25%~50%为阳性(+),阳性细胞>50%为强阳性(++)。

  1.4 统计学处理

  采用SPSS 11.5 统计软件,对实时PCR 数据行独立样本t 检验。对免疫组化数据行所有的P 值均双侧检验,P≤0.05 为具有统计学意义。免疫组化数据采用χ2精确概率法检验。

  2 结果

  2.1 BMI1 mRNA在胶质瘤及正常对照组织中的表达见表1。结果显示胶质瘤中BMI1 的表达明显高于对照组织(t=-3.73,P=0.001),Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中BMI1 的表达也明显高于Ⅱ级胶质瘤(t=-2.57, P=0.015)。但是在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤之间未发现表达差异(t=0.12,P=0.902)。

  2.2 BMI1 蛋白在胶质瘤及正常对照组织中的表达

  BMI1 阳性表达细胞呈散在分布,BMI1 阳性染色位于瘤细胞细胞核中,棕褐色,其阳性表达的程度随肿瘤恶性程度的增加而有所增加,在恶性脑胶质瘤组织中明显高于良性胶质瘤(图1)。

  见表2。结果显示在肿瘤组中BMI1 蛋白的表达要明显高于对照组(χ2=11.733,P=0.001);Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中BMI1 的表达要高于Ⅱ级胶质瘤(P=0.000)。

  3 讨论

  鼠BMI1 基因定位于10p13,在人类位于 10p11.23。BMI1 基因编码一个45kD 的蛋白,在胚胎干细胞、胎盘、胸腺、心脏、睾丸和脑组织中广泛表达。人们很早就认识到BMI1是一种癌基因,它与原癌基因c-Myc 协同作用,引起淋巴瘤的形成。 BMI1 对小脑的发育很重要,BMI1 基因敲除的小鼠神经系统有显著改变,BMI1 能促进神经干细胞的增殖,使造血干细胞保持增殖能力。近年,人们进一步认识到BMI1 是通过抑制INK4a 和ARF 编码蛋白,调控细胞周期、细胞衰老以及神经干细胞的自我更新能力。

  肿瘤抑制基因座INK 4a/ARF是BMI1的靶位点,这一基因座因为读码框不同而编码两种结构各异的肿瘤抑制蛋白p16INK4a 和ARF。在人类癌症中,INK4a/ARF 基因座是经常发生突变、删除和表观沉默的靶点。近年在人类癌症研究中发现BMI1 在一些血液系统疾病如非霍奇金淋巴瘤中扩增。BMI1 表达的失控不仅局限于血液肿瘤。大量研究均显示BMI1 在各种实体瘤肿瘤的形成中起着重要作用,如髓母细胞瘤、乳腺癌、和近年发现的肝癌、结肠直肠癌等,BMI1 均明显高表达。而且,多样本分析表明BMI1 的过表达还与导管性乳腺癌的腋窝淋巴结转移有关,这揭示BMI1 可能参与了恶性肿瘤的进展和转移。BMI1 蛋白的高水平表达还可以抑制前列腺癌细胞的凋亡,可以使前列腺癌细胞在转移过程中更好地存活,从而更好地在血循环中形成转移前体细胞团,这可能正是BMI1 促进恶性肿瘤的进展和转移的原因所在。研究同时还发现BMI1 阴性的恶性肿瘤患者的预后明显好于 BMI1 阳性患者。目前国外已有研究证实BMI1 阳性的恶性胶质瘤患者的2 年生存率明显低于BMI1 阴性的恶性胶质瘤患者。另一研究认为,BMI1 的高表达可以作为判断少枝胶质细胞瘤和少枝-星形细胞瘤预后的一个独立的指标,但与星形细胞瘤和胶质母细胞胞瘤的预后无相关性。

  胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的肿瘤,具有发病率高、复发率高、死亡率高以及治愈率低等特点,目前对于胶质瘤的治疗包括手术治疗、术后放疗、化疗、基因治疗以及免疫治疗等综合治疗,其中基因治疗是最有前景的方法之一。本研究通过对34 例胶质瘤标本和10 例对照标本使用实时 PCR 的结果显示,胶质瘤中BMI1 的表达显著高于正常对照组,而且在恶性胶质瘤中,BMI1 的表达高于良性胶质瘤。通过免疫组化的结果我们可以看出, BMI1 仅在胶质瘤瘤细胞的细胞核中表达。胶质瘤组中BMI1 的表达要显著高于正常对照组,随着胶质瘤级别的增高,BMI1 蛋白在胶质瘤中的表达存在增强的趋势,恶性胶质瘤中BMI1 蛋白的表达要显著高于良性胶质瘤。实时PCR 的方法和免疫组化的方法得出的结论相互吻合,这说明BMI1 对于胶质瘤来说也是一个癌基因。本研究发现BMI1 基因与胶质瘤的形成及恶性程度存在着一定的联系,很可能参与胶质瘤恶变的某些环节。 BMI1 在胶质瘤中的分子作用机制还需要进一步研究,需要在胶质瘤细胞系中进一步验证,而且我们还可以研究该基因与胶质瘤放化疗敏感性的相关性,及与胶质瘤预后的关系。在目前胶质瘤手术结合放、化疗效果不佳的情况下,也许可以为胶质瘤的基因治疗提供一个新的靶点选择。

  来自中国肿瘤临床2009年第36卷第11期

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